GenelGenel Kimya

Protein Elektroforezi

Protein Elektroforezi

Protein elektroforezi, proteinlerin karakterize etme yöntemlerinden biridir. Bu yöntem proteinlerin hem molekül büyüklüklerine göre, hem de taşıdıkları elektriksel yüke göre bir jel ortamında elektrik akımı verilerek yürütülmesidir.

Jel uygulanarak proteinlerin ağırlıkları bulunabilir. Matriks içinde farklı moleküler ağırlıkları ile orantılı olarak ayrılma ile bantları oluştururlar. Ayrılmada büyük proteinler ağırlıklarından dolayı geride kalırken küçük proteinler daha hızlı olup büyük proteinlere göre daha önde olur. Bu yöntemin özelliğine değinicek olursak üç boyutlu yapılarınının denatürasyonunu gerçekleştirerek proteinlerin özellik araştırmasında faydalı bir yol olarak kullanılır.

Protein elektroforezi 2 faz vardır. Biri hareketli diğeri hareketsiz fazdır. Hareketsiz faz olarak kağıt ,asetat, selüloz, poliakrilamid, agaroz gibi maddeler kullanılır. Hareketsiz ortamda ki en önemli özelliğine değinecek olursak moleküler yapıların porlardan kolaylıkla geçebilmesidir. Bu olay hareketli fazda tampon çözeltiler kullanılır.

Elektroforezin diğer yöntemlerden farkı bir elektriksel alan oluşturmasıdır. Böyle elektriksel alanda protein molekülleri farklı hızlarla bir elektrotun diğer elektrota hareket etmesiyle proteinler, molekül ağırlığı olsun ve atomlarındaki e- yükü olsun birbirlerinden ayrılabilirler. Boyama yöntemleri ile görünür hale getirebiliriz.

Protein elektroforezi de bir belirleme tekniği olan izoelektrik fokus  proteinin izoelektrik noktasını belirlemede kullanılır. Bu teknikte amfoter maddeler kullanılır. Bu yöntem de pH meyili oluşturulup, bazı proteinlerin belirli pH’ larda takılmasını sağlayıp karşıya doğru hareket edip ve/veya etmediğinin (pI) saptamasında kullanılır.

Proteinlerin farklı pI değerli vardır. Bu teknikte proteinler pH meyillerinde farklı tabakalar halinde kalırlar. Kısaca izoelektronik fokuslanma proteinlerin farklı izoelektrik noktalarını göz önünde tutarak birbirinden ayrılma metoduna göredir. Protein elektroforezinde olan bu yöntemde; en asidik anoda , en bazik olan da katoda doğru gider.

Proteinlerin jel üzerinde net yük 0 olan pH değerine (pI) kadar göç edip , bu noktada sabit dururlar. Son aşamada amfoter uzaklaştırılıp, boyama tekniği ile proteinler gözlemlenir.

Bazı Proteinlerin İzoelektrik Noktaları

  • Pepsin <1.0
  • Yumurta Albümini 4.6
  • Serum Albümin 4.9
  • Üre 5.0
  • ß-Laktoglobulin 5.2
  • Hemoglobin 6.8
  • Miyoglobin 7.0
  • Kimotripsinojen 9.5
  • Sitokrom c 10.7
  • Lizozim 11.0

Protein elektroforezi de ;  Jel filtrasyonunda  proteinler moleküler ağırlıklarına göre ayrılır. Jel filtrasyon kromotgrafisinde proteinler büyüklük şekillerine göre porlu matrikslere doldurulmuş bir kolondan geçirilerek ayrılır. Büyük ve geniş olan proteinler porların içine giremez ve kolonun altından ilk bunlar çıkar. Küçük proteinler por içinde girdiklerinde sıvı içinde hareket ederler en son kolondan ayrılırlar. Bu yöntem proteinlerin birbirinden ayrılması , sabit fazdaki jelin oluşturduğu porların çapına göre moleküllerin engellenmesine olanaktır.

Hareketsiz faz olarak kullanılan; sefadex biojel , agaroz vb. madde kolonda doldurulup , uygun tamponda yıkanıp kararlı hale getirilir. Sonrasında protein çözeltisi tamponla beraber yavaş bir şekilde ilave edilir. Cimsin aşağı doğru hareketinden doğru protein çözeltisi içinde bulunan küçük molekülleri kolonun küçük oyuklarına girerken , büyük proteinler bu oyuklara hiç girmez ve kolondan ilk çıkan molekül olurlar.

Birkaç Kromatografi Örneği;

  1. İyon değişim kromatografisi ; Proteinleri asit ve baz özelliklerini kullanarak ayrım yapan kromotografidir. Proteinler net yüklerine göre ayrılırlar.
  2. Affinite Kromatografisi: Karışımhalinde bulunan proteinleri saf halde elde etmek için kullanılır.

Kaynaklar;

  1. Jenkins, Margaret A. (1999). “Serum Protein Elektroforezi”. Kapiler Elektroforezin Klinik Uygulamaları . Moleküler Tıpta Yöntemler
  2. Keren, David F. (2003). Klinik Tanıda Protein Elektroforezi
  3. Hofmann, Andreas; Clokie, Samuel, editörler. (19 Nisan 2018). Wilson ve Walker’ın Biyokimya ve Moleküler Biyoloji İlkeleri ve Teknikleri . İngiltere: Cambridge University
  4. Boyer, Rodney F. – Modern Deneysel Biyokimya . ABD: Pearson, 3. baskı
  5. Robyt, John F .; Beyaz, Bernard J. (1990). Biyokimyasal Teknikler Teorisi ve Uygulaması . Waveland Press

İzzethan Öztop

Lisans : Moleküler Biyoloji ve Genetik/ Moleküler Biyolog ve Webmaster/ Aynı zamanda bir makale yazarı

İlgili Makaleler

Bir cevap yazın

Başa dön tuşu